摘要：短程反硝化是非常有前景的硝酸盐废水前处理方法，可为厌氧氨氧化提供必需的底物（NO2--N），而不同碳源投加方式会影响短程反硝化的性能。在进水NO3--N为100mg/L、乙酸钠为碳源、碳氮比为2的条件下，探究了不同碳源投加方式（1次投加、3次投加、6次投加）对短程反硝化氮素转化特性及反应速率的影响。结果表明，分次投加碳源可以在短时间内启动高效稳定的短程反硝化，且6次投加方式条件下短程反硝化性能最优。6次投加碳源（t=0/10/20/30/40/50 min）条件下短程反硝化出水NO3--N、NO2--N平均浓度分别为7.33、60.92mg/L，NO3--N至NO2--N的平均转化率（NTR）为86.55%，NO3--N比还原速率和NO2--N比还原速率分别为26.79、4.14mg/（g·h）。高通量测序结果显示，拟杆菌门和变形菌门是短程反硝化系统中的优势菌门。在研究过程中，短程反硝化功能菌属Thauera丰度逐渐增加，3种投加方式下其相对丰度分别为0、14.29%、17.11%，说明与短程反硝化相关的优势菌得到富集。

短程反硝化（PD）是指NO3--N还原到NO2--N的过程，相比于完全反硝化过程可节约60.10%的外加碳源。有研究表明，通过控制污泥类型、碳源种类、碳氮比（C/N值）、pH值、碳源投加方式等条件可以实现短程反硝化和NO2--N积累。毕春雪等、张星星等利用不同污泥快速启动了PD，NO2--N转化率（NTR）分别在80%、70%左右。Ge等研究发现添加不同碳源时，添加葡萄糖碳源条件下亚硝酸盐积累率最高，较高C/N值会获得更高的NO2--N积累量。Gong等用乙酸钠作为碳源时，发现在C/N值=1.4～3.5时NO2--N都能有效积累。Qian等发现当系统pH值从5.0增至9.0时，反应器中NTR逐渐升高，而且pH值=9.0时短程反硝化关键细菌Thauera的相对丰度最高。王淑莹等研究表明，以污泥发酵液为碳源，分次投加和1次投加对短程反硝化系统中NTR的峰值影响不大，但分次投加更有利于NO2--N稳定积累。在反硝化耦合厌氧氨氧化系统中，分次投加污泥发酵液不会降低厌氧氨氧化活性。Du等发现，在反硝化氨氧化（DEAMOX）系统中，总氮超过500mg/L时，分次投加碳源能明显提升PD过程的NTR。

目前虽有少部分文献报道了碳源投加方式对PD的影响，但这些研究多是采用短程反硝化-ANAMMOX耦合工艺分析碳源投加方式对整体脱氮效果的影响，而碳源投加方式对PD中氮素转化特性和转化速率的影响鲜有研究。因此，笔者采用序批式反应器（SBR）处理模拟硝酸盐废水，以乙酸钠为碳源，探究在不同碳源投加方式下PD工艺的启动以及运行性能的差异情况，并利用高通量测序技术分析不同条件下微生物群落变化，旨在为硝酸盐废水的处理提供理论支持。

01 材料与方法

1.1 实验装置

实验装置采用SBR反应器，由有机玻璃制成，有效体积为3L，长为11cm，宽为11cm，高为40cm，见图1。在反应器上方安装JJ-1型悬臂式搅拌器，搅拌速度为200r/min，以保持反应过程中的完全混合且溶解氧不超过0.2mg/L。使用哈希HQ30d溶解氧仪测定溶解氧，雷弗BT100L型蠕动泵控制进水和碳源投加，德力西2W040-10型电磁阀进行排水。使用YX25L型温控加热盘控制反应器内温度在24～25 ℃。

1.2 实验方案

SBR每天运行2个周期，每周期进水1.5L，排水比为50%。本实验分为两个阶段，阶段Ⅰ为反应启动阶段：厌氧搅拌360min（包括进水2min），沉淀30min，排水5min；阶段Ⅱ为碳源投加方式探究阶段：厌氧搅拌240min（包括进水2min），沉淀30min，排水5min。

整个实验过程进水NO3--N为100mg/L，使用乙酸钠溶液（COD为25g/L）提供反应所需碳源，控制反应起始C/N值为2。第Ⅰ阶段（第1～10天）分4次投加碳源，即在t=0/1/2/3 h分别投加3 mL乙酸钠溶液，旨在启动短程反硝化。第Ⅱ阶段采用3种碳源投加方式，即1次投加方式（第11～28天，在t=0min时投加12mL乙酸钠溶液）、3次投加方式（第29～47天，在t=0/30/60min分别投加4mL乙酸钠溶液）、6次投加方式（第48～68天，在t=0/10/20/30/40/50 min分别投加2mL乙酸钠溶液）。3种投加方式各选取3个周期进行单周期连续取样。每天监测SBR反应器进、出水的NO3--N、NO2--N、pH值。

1.3 接种污泥与实验进水

接种污泥取自实验室培养成熟的全程自养脱氮污泥，接种后SBR反应器内混合液的MLVSS为1500mg/L，30d排泥1次。

实验进水为人工配制的模拟废水，主要包括NaNO3、微生物生长所需的营养元素、微量元素A及B溶液，pH值为7.5～8.5。

1.4 分析项目及方法

水样首先经过0.45μm纳滤膜过滤，然后分别采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法、紫外分光光度法、PHS-3C型pH计、马福炉灼烧重量法测定NO2--N、NO3--N、pH值、MLVSS；微生物群落结构采用高通量基因测序技术进行分析。

NTR、比转化速率参考文献进行计算。

02 结果与分析

2.1短程反硝化系统的启动

图2反映了反应器内PD启动过程中NO3--N、NO2--N浓度及NTR变化情况。进水NO3--N为100mg/L，乙酸钠为唯一碳源，碳源分4次投入SBR反应器中，PD系统经过19个周期的驯化完成启动。启动可分为两个阶段：第1～9周期，PD活性增强阶段；第10～19周期，PD活性稳定阶段。第1～9周期，反应器出水NO3--N浓度从26.89mg/L降至12.39mg/L，NO2--N浓度从0.75mg/L增加到44.9mg/L，NTR从22.00%升至86.17%，此时认为系统中PD性能逐渐增强。第10～19周期，反应器出水NO3--N和NO2--N平均浓度为12.53mg/L和61.41mg/L，NO2--N高积累量得以维持，NTR平均为89.78%、最大为97.09%，说明经过19个周期的驯化，在SBR反应器中成功启动了PD系统。

目前，大多数研究者启动PD采用一次性投加碳源的方法。毕春雪等在SBR反应器中通过一次性投加乙酸钠耗时21d启动了PD，张星星等采用3种不同的污泥源耗时9d启动了PD系统，且NTR均仅在70%左右。本实验采用的SBR反应器仅经过19个周期（10d）的运行，NTR就达到89.78%，在短时间内完成了高效稳定PD系统的启动，因此可以认为分次投加碳源有利于SBR反应器中PD的启动。

2.2 碳源投加方式对短程反硝化的影响

2.2.1 氮素转化特性

不同碳源投加方式对PD系统氮素转化特性的影响如图3所示。进水NO3--N为100mg/L，一次性投加时，反应器出水NO3--N、NO2--N平均浓度分别为17.18、49.24mg/L，NTR平均为75.10%、最大达到88.62%。前10d反应器中NTR稍有波动，后趋于稳定。3次投加方式条件下，反应器出水NO3--N、NO2--N平均浓度分别为12.28、58.9mg/L，NTR平均为81.55%，比一次性投加时高6.45%，NTR最大为88.72%，与一次性投加时相差不大，说明3次投加时反应器出水NTR波动不大。6次投加方式条件下，反应器出水NO3--N、NO2--N平均浓度分别为7.33、60.92mg/L，NTR平均为86.55%、最高可达96.14%。

在不同的投加方式下，PD系统出水NO3--N、NO2--N浓度差异明显。在其他运行条件相同的情况下，随着碳源投加次数的增多，SBR反应器出水NO2--N浓度、NTR呈上升趋势，NO3--N剩余量呈下降趋势，说明碳源投加次数增多有利于提升反应器内PD活性。碳源分6次投加可以在最大限度上促使NO3--N转化为NO2--N，同时进行完全反硝化的NO3--N比例下降，因此积累了高浓度的NO2--N。少量多次地投加碳源可使反应器中的有机物浓度处于较低水平。在较低的C/N值条件下，硝酸盐还原酶的活性大于亚硝酸盐还原酶的活性，NO3--N优先还原为NO2--N，使NO2--N得以积累。

2.2.2 典型周期转化速率

图4展示了不同碳源投加方式下SBR反应器中PD典型周期内NO3--N、NO2--N浓度及NTR变化情况。各条件下典型周期实验次数为3次。一次性投加时，在前60min，反应器出水NO3--N浓度由64.63mg/L降至28.15mg/L，NO2--N浓度从12.68mg/L升至41.72mg/L，60min时NTR达到峰值80.09%。在后续180min反应时间内，NO2--N仅增加了3.94mg/L，NO3--N仅减少了9.45mg/L。3次投加时，反应器出水氮素浓度变化主要在前90min内，NO3--N在0～90 min和90～240min的浓度分别下降了43.39、7.37mg/L，NO2--N则分别增加了30.83、4.21mg/L，但NTR峰值仍出现在60min时，为72.46%。6次投加时，在前60min完成了大部分NO2--N的积累，反应器出水NO2--N增加了33.80mg/L，NO3--N减少了39.90mg/L，60min时NTR最大为84.50%。3种投加方式下反应器内NO3--N减少量均大于NO2--N积累量，二者差值越小，说明反应器内NO2--N的还原量越少，NTR越高。

此外，3种投加条件下SBR反应器出水NO3--N、NO2--N浓度及NTR变化趋势基本相似。在反应前期，反应器出水NO3--N浓度随着反应的进行而逐渐降低，NO2--N浓度不断积累升高。这是因为在反应初期，硝酸盐还原菌的底物NO3--N和碳源充足，硝酸盐还原酶可结合的电子供体与受体增加，NO3--N可快速转化为NO2--N。反应一段时间后，反应器中NO3--N、NO2--N浓度变化不大，是因为反应后期NO3--N和碳源浓度较低，反应变慢，NO3--N和NO2--N变化不明显，因此二者浓度及NTR比较稳定。有研究表明，当C/N值大于3（超过了完全反硝化所需要的碳源量）时出水NO2--N浓度随反应的进行而先增加后减少。而本实验中C/N值为2，且通过分次投加降低了反应期间碳源浓度，使反应器中不明显发生完全反硝化，才成功在反应后期稳定积累NO2--N浓度。3种碳源投加方式下，反应器中的NTR呈微弱的先上升后下降的趋势，且均在60min时达到最大值。经比较可知，6次投加方式下反应器出水NO2--N浓度和NTR都达到最高水平。

在前4次取样时间内，反应器内NO3--N减少量和NO2--N积累量与时间呈线性关系，R2>0.95。典型周期内的PD反应速率可由拟合后的二者浓度变化以及污泥浓度MLVSS来确定，结果如图5所示。

在3种投加方式中，6次投加时NO3--N比还原速率、NO2--N比积累速率最大，分别为26.79、22.65mg/（g·h），3次投加方式的NO3--N比还原速率、NO2--N比积累速率最小，分别为19.42、13.95mg/（g·h）。此外，无论何种投加方式，NO3--N比还原速率远大于NO2--N比还原速率。一次性投加时，NO3--N比还原速率是NO2--N比还原速率的4.82倍，3次、6次投加时分别为3.55、6.47倍。6次投加方式的NO3--N比还原速率与NO2--N比还原速率相差最大，NO2--N得以更好地积累，与在该条件下PD系统具有较高的NTR相一致。由此可以认为，NO3--N比还原速率大于NO2--N比还原速率是NO2--N积累的直接原因，这与王淑莹等、Cao等的研究结果相似。

2.3 微生物群落分析

利用16SrDNA高通量测序进一步了解不同运行条件下反应器中微生物群落结构的变化情况。seed取自反应器运行第1天（接种污泥）、R1取自反应器运行第16天（1次投加方式）、R3取自反应器运行第35天（3次投加方式）、R6取自反应器运行第57天（6次投加方式）。4个污泥样品的Coverage值分别为98.80%、97.68%、99.60%、99.74%，有较高的样本文库覆盖率，说明本次测序有效。Shannon值用来表征微生物群落的多样性，其数值越大，多样性越高。seed、R1、R3、R6的Shannon值分别为5.69、8.02、6.19、7.10，说明R1比其他样品的物种多样性要高，即seed、R3、R6中微生物的专一性更高，功能细菌的优势更强。

SBR反应器中各时期污泥样品门水平、属水平的微生物群落丰度见图6。从图6（a）可知，4个污泥样品中分别检测出9、11、18、15种已知菌门，有6种主要菌门（相对丰度>1.0%），分别为拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和Patescibacteria菌门。按照丰度由高到低排序，seed中优势菌门为拟杆菌门（84.08%）、厚壁菌门（14.86%）；R1中优势菌门为拟杆菌门（70.50%）、厚壁菌门（25.60%）以及Patescibacteria菌门（1.59%）；R3中优势菌门为拟杆菌门（38.49%）、变形菌门（32.73%）、绿弯菌门（22.35%）、浮霉菌门（4.28%）；R6中优势菌为变形菌门（47.71%）、绿弯菌门（22.62%）、拟杆菌门（22.35%）、浮霉菌门（4.96%）。可以发现，R3、R6中出现了seed、R1中没有的绿弯菌门，绿弯菌门是含有绿色素的兼性厌氧细菌，可以分解糖类物质并进行脱氮。拟杆菌门的丰度逐渐降低，变形菌门的丰度逐渐升高，R6中变形菌门占47.71%，此丰度与已有文献中活性污泥变形菌门的丰度相近。污水处理中常见的反硝化菌属大多属于变形菌门，变形菌门可以在降解有机物的同时脱氮除磷，因此，高丰度变形菌门是PD系统中高NTR的保证。

从图6（b）可知，R3、R6新增了前两个样品中未检测出的反硝化菌属Thauera，相对丰度分别为14.29%、17.11%。Thauera是PD研究中实现NO2--N积累的功能菌属。Du等的研究接种已驯化成功且稳定运行的反硝化污泥，发现在实验后期Thauera是PD工艺中的绝对优势菌属，相对丰度为67.25%。而本实验接种污泥为实验室培养成熟的全程自养脱氮污泥，反应后期才出现Thauera，条件的优化使与PD相关优势菌得到富集，这与6次投加时效果最优的结论一致。

03 结论

①在常温（24～25 ℃）下，当进水NO3--N为100 mg/L、C/N值=2时，碳源分次投加，可以在短时间（10d）内启动高效稳定的PD系统。

②6次投加方式下SBR反应器中PD运行效能最好。6次投加方式下出水NO3--N、NO2--N平均浓度分别为7.33、60.92 mg/L，NTR平均为86.55%，NO3--N比还原速率最大[26.79mg/（g·h）]，NO2--N比还原速率最小[4.14mg/（g·h）]。

③碳源投加次数增多有利于提升SBR反应器内PD的活性，促进反应器出水NO2--N的积累，可为后续ANAMMOX脱氮提供充足的基质。

④拟杆菌门和变形菌门是PD系统中的优势菌门，在3次投加和6次投加的污泥中出现的新菌属Thauera是众多已报道PD研究中实现NO2--N积累的功能菌属，Thauera的富集能维持PD系统的稳定。